Protocolo #001: qRT-PCR, SYBR Green y Sondas Taqman

En el ámbito de la investigación, la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR es una de las técnicas más utilizadas dentro del laboratorio. Esta técnica permite amplificar una molécula de ADN, generando un gran número de copias de la misma, las cuáles pueden ser usadas para diferentes finalidades posteriormente.

Taq
Taq DNA polymerase

Con el paso del tiempo, se ha desarrollado una variante llamada RT-PCR (no debe ser confundida con la “real time PCR“), que consiste en la amplificación de moléculas de ARN al convertirlas previamente en moléculas de cDNA empleando una retrotranscriptasa.

RT2
Retrotranscriptasa

De forma adicional, la generación de las copias de las moléculas de ARN y ADN amplificadas puede ser medida para así determinar si la expresión de un gen en una célula es mayor a la de otro o si se ve afectada al recibir la célula algún tipo de tratamiento. En este caso, la técnica pasa a llamarse qPCR o qRT-PCR, siendo quantitative el significado de la letra “q” añadida al principio.

La cuantificación puede realizarse empleando diferentes métodos. Hoy os hablaré de dos en concreto: el colorante SYBR Green y las sondas Taqman.

  • SYBR Green: se trata de un agente intercalante capaz de unirse a cualquier SYBR Green - On_Mesa de trabajo 1.pngmolécula de ADN de doble cadena presente en el medido en el que es añadido. Por tal motivo, uno de sus puntos negativos es la inespecificidad que presenta este compuesto, teniendo como consecuencia la sobreestimación del número de transcritos presentes en una muestra en caso de que moléculas de ADN foráneo la hayan contaminado.
  • Sondas Taqman: consisten en sondas de ADN que incorporan una molécula fluorescente en el extremo 5’ y su quencher correspondiente en el extremo 3’. Esta sonda se une a zonas complementarias de hebras monocatenarias de cDNA o ADN, y es cortada por la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa. Como consecuencia, el fluoróforo es escindido y, al alejarse, se libera de la inhibición del quencher, logrando emitir fluorescencia. A medida que el número de copias aumenta con el paso de los ciclos, la fluorescencia sufre también un aumento proporcional, ya que las sondas se unen a las nuevas hebras monocatenarias sintetizadas y son escindidas por el avance de la Taq polimerasa durante la replicación.

sonda_mesa-de-trabajo-1.pngLas fluorescencia emitida en cada una de las técnicas es detectada, medida y analizada por la máquina de PCR cuantitativa en tiempo real. A continuación os dejo un vídeo que realicé para una asignatura de la universidad en el que explico un protocolo concreto de qRT-PCR que emplea SYBR Green, así como su variante empleando sondas Taqman. Además, también hablo del funcionamiento de estas dos técnicas. ¡Espero que lo disfrutes!

 

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